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我院蔣沁/顏標/趙晨研究團隊采用Cre條件敲降模型研究cZNF532在糖尿病視網膜病變中的機制

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我院蔣沁/顏標/趙晨研究團隊采用Cre條件敲降模型研究cZNF532在糖尿病視網膜病變中的機制

發布日期:2020-05-06
近日,南京醫科大學第四臨床醫學院附屬眼科醫院在線發表了糖尿病視網膜病變的最新成果。論文以“Circular RNA-ZNF532 regulates diabetes-induced retinal pericyte degeneration and vascular dysfunction”為題,在國際權威雜志《Journal of Clinical Investigation》發表,該雜志最新影響因子為12.282,報道糖尿病視網膜病變中環狀RNA cZNF532高表達,與視網膜血管周細胞退化有關。本課題組通過Cre雜交的條件性敲降cZNF532的模型研究發現cZNF532可以通過競爭性結合miR-29a-3p,促進NG2,LOXL2和CDK2的表達。南京醫科大學附屬眼科醫院蔣沁,復旦大學附屬眼耳鼻喉醫院顏標,趙晨為本文的共同通訊作者。
?糖尿病視網膜病變血管周細胞特異性高表達cZNF532

為篩選高糖誘導的高表達的circRNA分子,通過高通刺激后芯片分析差異表達circRNA分子,本課題組在人視網膜周細胞中發現了來自ZNF532的一個circRNA,circ_0047814 (circBase ID: hsa_circ_0047814; circBank ID: hsa_circZNF532_007)表達異常。通過Sanger測序證明了Junction位點的序列,RNase R處理證明是環形分子。RNA-FISH結果顯示cZNF532主要定位于胞質中。小鼠糖尿病模型不同時間段的視網膜血管細胞QPCR檢測表明cZNF532在糖尿病模型中顯著高表達。血管周細胞中高糖,氧化應激(H2O2處理)或炎癥刺激(VEGF,IL-6,TNF-α處理)均可顯著促進cZNF532的表達。人視網膜血管內皮細胞(HRVECs)中對應的變化不明顯。說明高糖刺激后cZNF532在視網膜血管周細胞中特異性的表達增高。

圖1 circRNA表達譜分析將cZNF532鑒定為糖尿病視網膜病變的潛在調節因子([1])

?cZNF532在視網膜血管周細胞中功能研究
cZNF532特異性的siRNA能夠有效敲降cZNF532,但對母基因ZNF532沒有影響。血管周細胞中干擾cZNF532可顯著降低周細胞標志物的表達,如(PDGFR)-β,α-SMA,Desmin以及NG2。Matrigel共培養實驗表明干擾 cZNF532顯著降低血管周細胞向HRVECs聚集的能力,并且增加周細胞對大分子的通透性。MTT分析表明干擾cZNF532可抑制血管周細胞的增殖能力,誘導G0/G1期阻滯,促進血管周細胞的凋亡。
圖2 cZNF532在體外調節視網膜周細胞功能([1])

?體內cZNF532調節視網膜周細胞功能和血管完整性

糖尿病模型中通過玻璃體注射cZNF532的shRNA載體能夠顯著抑制cZNF532的表達,IB4和NG2染色可檢測視網膜血管周細胞覆蓋的程度。結果表明在第一個月的時間點,單獨的糖尿病模型組和單獨干擾cZNF532組沒有顯著的周細胞覆蓋度變化,但糖尿病組聯合干擾cZNF532能顯著降低血管周細胞的覆蓋度。第二至第六個月,單獨的糖尿病模型組和單獨干擾cZNF532組呈現出周細胞覆蓋度的顯著變化,兩者組合后周細胞在血管覆蓋度差異更明顯。Evans blue實驗表明干擾cZNF532可顯著增視網膜的滲漏。

圖3 cZNF532在體內調節糖尿病誘導的視網膜血管功能障礙([1])

?血管周細胞條件性敲降cZNF532
Cre條件敲除模型可以客觀而系統地研究目的基因在不同組織器官發生、發育或疾病發生、治療過程中的作用與機制,在傳統mRNA基因的功能研究中扮演著非常關鍵的作用。circRNA目前還沒有成熟的敲除體系,尤其是考慮到不影響母基因的表達,但基于shRNA的敲降是可行的。為此,本課題組設計了Cre條件誘導表達shRNA的AAV載體,通過注射AAV載體到Cre模型小鼠中實現條件性敲降circRNA的動物模型。
本課題組采用PDGFR-β-cre小鼠,該小鼠的Cre酶僅在PDGFR-β基因陽性的細胞和組織中表達,例如血管周細胞等等。用該基因的啟動子構建的Cre小鼠也可以實現在這些類型的細胞中特異性表達Cre酶。結果顯示在該模型中,可以特異性對血管周細胞的cZNF532實現條件性敲降,而血管內皮細胞中沒有發生變化。在這種條件性敲降cZNF532模型中分析血管周細胞覆蓋度和血管完整性,結果表明敲降血管周細胞中cZNF532可以顯著降低血管周細胞覆蓋度和血管完整性。
圖4 血管周細胞條件性敲降cZNF532影響糖尿病誘導的視網膜血管功能([1])

?cZNF532 競爭性結合miR-29a-3p
基于熒光素酶報告基因篩選,本課題組發現miR-29a-3p是cZNF532競爭性結合的下游miRNA分子。通過突變分析,QPCR表達檢測,共定位分析,熒光素酶報告基因分析等實驗驗證了這一競爭性結合的作用關系。進一步驗證了CSPG4,LOXL2和 CDK2是miR-29a-3p的下游靶基因。
圖5 cZNF532通過在體外充當miRNA海綿來調節周細胞功能([1])

?cZNF532 競爭性結合miR-29a-3p的體內作用機制

博亿娱乐 為證明cZNF532-miR-29a-3p-NG2/LOXL2/CDK2通路在糖尿病視網膜病變模型中與視網膜周細胞功能和血管完整性的關系。應用miR-29a-3p激動劑可顯著降低血管周細胞的覆蓋度和血管完整性。最后,本課題組通過臨床樣本分析驗證cZNF532-miR-29a-3p-NG2/LOXL2/CDK2通路,證明該通路與糖尿病導致的視網膜血管功能障礙有一定的關系。

圖6 體內驗證cZNF532-miR-29a-3p-NG2/LOXL2/CDK2通路 ([1])

?臨床標本驗證cZNF532-miR-29a-3p-NG2/LOXL2/CDK2通路
最后,本課題組通過臨床樣本分析驗證cZNF532-miR-29a-3p-NG2/LOXL2/CDK2通路,證明該通路與糖尿病導致的視網膜血管功能障礙有一定的關系。
圖7 臨床標本驗證cZNF532-miR-29a-3p-NG2/LOXL2/CDK2通路 ([1])

?cZNF532作用機制模型 
本文發現糖尿病視網膜病變中cZNF532高表達,cZNF532可以通過競爭性結合miR-29a-3p,調控了NG2/LOXL2/CDK2等基因的表達,最終影響周細胞在視網膜血管的覆蓋水平和血管通透性,在糖尿病視網膜病變過程中發揮作用。
圖8  cZNF532作用機制模型([1])

參考文獻:
1. Jiang, Q., et al., Circular RNA-ZNF532 regulates diabetes-induced retinal pericyte degeneration and vascular dysfunction. J Clin Invest, 2020.

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